大巴車凌晨2點至5點在高速上必須休息。根據《道路旅客運輸企業安全管理規范》：長途客運車輛凌晨2時至5時停止運行或實行接駁運輸，凌晨2點后禁止長途客車從收費站口上高速，對此時間段內正在高速公路上行駛的長途客車就近引導到服務區或客運站停車休息。從事線路固定的機場、高鐵快線以及短途駁載且單程運營里程在100公里以內的客運車輛，在確保安全的前提下，不受凌晨2時至5時通行限制。